雞透明質(zhì)酸檢測試劑盒的使用步驟和方法

　　雞透明質(zhì)酸檢測試劑盒的使用步驟和方法：

　　一、樣品DNA的制備

　　用自選方法提取待測樣品的總DNA。注意：待測樣品的DNA純化方法是決定檢測靈敏度的關(guān)鍵因素。如果不能很好純化樣品DNA，后面的PCR再靈敏也不能提高整體檢測靈敏度。

　　二、制備TB基因標(biāo)準(zhǔn)曲線

　　（以10-10E6這6個10倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或雞透明質(zhì)酸檢測試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體病毒做陽性對照，只提供沒有傳染性的、可以直接使用的DNA片段作為陽性對照。

　　1.標(biāo)記6個離心管，分別為6，5，4，3，2和1號。

　　2.用帶芯槍頭分別加入45μL超純水（建議用帶芯槍頭，下同）。

　　3.先將雞透明質(zhì)酸檢測試劑盒提供的陽性對照用超純水10倍梯度稀釋到10E7拷貝/μL（注：請不要將雞透明質(zhì)酸檢測試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品一次性稀釋至10E7拷貝/μL，建議每次稀釋10倍剃度稀釋，梯度稀釋至10E7拷貝/μL）。

　　4.在6號管中加入5μL10E7拷貝/μL的TB陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得10E6拷貝/μL的TB陽性對照。

　　5.換槍頭，從6號管中取5μL溶液到5號管中，充分震蕩1分鐘，得10E5拷貝/μL的TB陽性對照。

　　6.換槍頭，從5號管中取5μL溶液到4號管中，得10E4拷貝/μL的TB陽性對照。

　　7.重復(fù)上面的操作直到得到從10E6拷貝/μL到10E1拷貝/μL6個稀釋度的TB陽性對照。

　　8.NC管中不加任何陽性對照。

　　9.從1-6號管中分別取5μL和待測樣品一起進(jìn)行定量PCR（見下步），每個樣品做3次重復(fù)。PCR后得到每個陽性對照稀釋樣品的熒光PCRCt值，并以之為縱軸，以濃度的對數(shù)值為橫軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。